唾液酸化指南：II.高度唾液酸化糖蛋白

聚糖唾液酸化对药物的安全性和有效性很重要

在人类中，聚糖上的主要唾液酸是Neu5Ac，然而，Neu5Gc（其具有糖基而不是乙酰基）可以添加到在不同细胞系中表达的糖蛋白中。这种非人Neu5Gc可引发免疫反应，其可导致生物制药的炎症和/或中和（因此失去功效）。聚糖的唾液酸化也会对药物的药代动力学特性产生重大影响：例如，具有末端半乳糖（不含唾液酸）的聚糖会被肝脏中的无唾液酸糖蛋白受体从循环中去除。糖蛋白，如EPO，可能含有额外乙酰化的唾液酸（如Neu5,9Ac2），这可能会影响药物疗效。唾液酸化对受体结合和信号转导也很重要；例如，IgG-Fc聚糖上唾液酸的存在降低了ADCC（抗体依赖性细胞毒性）活性并具有抗炎作用。

唾液酸的鉴定和定量：

a）DMB唾液酸标记试剂盒（Cat#D491322），通过（U）HPLC分析释放、鉴定和获得Neu5Ac、Neu5Gc和Neu5,9Ac2的相对定量。我们使用荧光标记DMB来特异性标记唾液酸，然后使用（U）HPLC结合荧光检测来检测和定量唾液酸（见图1）。使用荧光标记使测定比PAD更敏感。由于DMB标签仅在标记唾液酸（跨越2个相邻的酮基）时才变为荧光，这种特异性还克服了样品缓冲液中其他成分引起的问题（这可能与PAD检测有关）。

b） 糖蛋白上Neu5Ac和Neu5Gc的绝对量也可以通过与Ludger定量标准（Cat#B491176、B491217）进行比较来确定。

c） 建议使用定量唾液酸化糖肽标准品来检查聚糖释放、标记和回收的效率。

图1：来自唾液酸参考面板的DMB荧光标记唾液酸（通过轻度酸水解释放）的RP-HPLC分析。此参考面板是D491322套件的一部分。

唾液酸化聚糖的分析和表征

N-聚糖通过PNGase F（Cat#P420186）从生物制药中去除。使用含有2-吡啶硼烷还原剂的LudgerTag试剂盒，用2AA或2AB荧光标记聚糖，并使用滤筒清洁。

a） HILIC-（U）HPLC分析提供了GU值，可与数据库和标准GU值匹配，以获得初步结构分配。

b） 外糖苷酶测序后的进一步分析可用于表征存在的结构（图2）。例如，在用唾液酸酶（Cat#N489858）消化后消失（或减少）的峰将含有唾液酸化结构。

图2：EPO的外糖苷酶测序；2AB标记的聚糖在LudgerSep-N2柱上运行酶特异性：a3Sialic=1-3唾液酸；a36唾液酸＝1-3和6唾液酸；Fuc＝1-6岩藻糖；bGal＝b1-4半乳糖；GlcNAc=b1-2,4,6 N-乙酰氨基葡萄糖。

c） 在弱阴离子交换（WAX）柱上标记的聚糖的电荷分离可以提供关于单唾液酸化聚糖、二唾液酸化聚糖和四唾液酸化聚糖的相对比例的数据。（图3）。

图3:柱上2AB标记聚糖的弱阴离子交换（WAX）-HPLC电荷分离。顶部痕量（红色）：胎球蛋白N-聚糖。底部痕量（蓝色）：EPO N-聚糖

对于复杂的混合物，这些不同电荷的部分可以通过 HILIC-(U)HPLC 和外切糖苷酶测序进一步分离和分析，以充分表征结构（图 4）：

图4：通过WAX-HPLC和HILIC-UPLC对EPO N-聚糖进行电荷分级。

d） 质量组成数据可通过甲基化后的MALDI分析获得，以稳定唾液酸（图5）。

图 5：全甲基化 EPO N-聚糖的 MALDI 分析